摘要

hERG（KCNH2/Kv11.1）电流抑制至今仍是药物诱导延迟复极、QT/QTc 延长以及尖端扭转型室速（torsade de pointes, TdP）风险评估中最关键的非临床输入之一。不过，监管科学已经不再停留于“hERG 阳性 / QT 延长”式的二元判断，而是逐步演进为更强调机制证据、整合判读和临床情境关联的综合性评估体系。2005 年发布的 ICH S7B 与 E14 分别建立了非临床和临床 QT 风险评价的基础框架；2022 年发布的 E14/S7B 问答则进一步明确了整合风险评估思路、体外离子通道研究的最佳实践，以及支持后期开发与标签决策的非临床—临床联合论证路径。与此同时，CiPA（Comprehensive in Vitro Proarrhythmia Assay）理念的提出，也推动行业从单纯依赖 hERG 与 QTc 的传统范式，转向多离子通道数据、体外模型、体内结果和 in silico 模型综合解释的新路径。

从生物学角度看，hERG 编码快速延迟整流钾电流 IKr 的关键孔形成亚基，其功能缺失与先天性长 QT 综合征 2 型（LQT2）密切相关，而药物性 hERG 阻断则是获得性 QT 延长最常见的分子机制之一。但需要强调的是，延迟复极本身并不等同于 TdP。它更准确的定位是：为早后除极和触发活动提供了发生土壤，因此具有很高的风险敏感性，却并不具备完全充分的特异性。心肌动作电位的平台和复极过程同时受到多种离子通道共同调控，因此，单独依据 hERG 结果并不足以完整推断临床致心律失常风险。

在方法学层面，手动全细胞膜片钳依然是离子通道功能检测的重要金标准之一。它的优势主要体现在：单细胞分辨率高、灌流和协议控制灵活、便于识别异常细胞或微量沉淀、适合做机制研究与复杂化合物桥接验证；其代价则是通量相对较低、对操作者培训要求高、实验室间差异更难自然消除。依据当前 ICH S7B Q&A 2.1 以及 FDA 推荐协议，hERG 主方案应优先采用接近生理温度（35–37°C）、更接近心室复极过程的 step-ramp 波形、≥1 GΩ 封接、明确记录串联电阻补偿策略、名义浓度与实测浓度双重记录，并在试验末端加入 E-4031 做全阻断，以便对背景电流进行合理扣除，同时对 run-down、未达稳态等时间依赖性偏差实施质量控制。

关于本白皮书

本白皮书的核心观点是：hERG 手动膜片钳筛选的“最佳实践”不应被理解为一组孤立参数的拼接，而应被理解为同一实验室中经过校准、可重复、可追溯、并且能够与临床暴露框架衔接的一整套方法学体系。安全边际的计算不能脱离协议、参考药和实验室历史数据表现而机械套用文献阈值。尤其是在近期多实验室标准化研究已经提示 hERG IC₅₀ 的自然变异可接近 5 倍的背景下，“阴性”或“低风险”结论都必须依赖实验室特异性的参考区间、参考化合物集合和不确定性表征来解释。最终的心脏风险判断，应将 hERG 结果与临床相关暴露倍数、体内 QT 结果、必要时的心肌细胞 / 动作电位结果以及 CiPA in silico 预测联合解读。

本文以白皮书形式系统论述 hERG（Kv11.1/KCNH2）手动全细胞膜片钳筛选方法及其在药物心脏安全评价中的应用。全文内容覆盖监管背景、通道生物学基础、标准操作流程、数据采集与统计分析、方法学验证、风险外推、局限性与故障排查、报告模板以及伦理与法规要求。本文以 ICH 2005 年版 S7B、E14 及其 2022 年问答，FDA 推荐的重组细胞离子通道研究协议，以及 CiPA 相关公开同行评议文献为主要依据展开综合分析。文中默认假设为：未指定细胞系、候选物类型及平台品牌时，采用无特定限制条件下的示例性主方案；因此，本文提出的 SOP 更适合作为“与监管预期一致、便于实验室落地、但仍需本地桥接验证”的实施模板，而非唯一路径。总体而言，hERG 手动膜片钳在延迟复极风险识别中仍然具有不可替代性，但其对 TdP 的预测价值，取决于实验条件的标准化程度、药物暴露是否经过实测核验、是否结合多通道信息进行补充，以及是否在临床暴露情境下做出整合判读。

引言

3.1 背景与监管语境

ICH S7B 的最初目标，是建立一套非临床策略，用于识别候选化合物及其代谢物延迟心室复极的潜力，并尝试将这一效应与体内暴露水平联系起来。该指导原则明确指出，体外 IKr/hERG 研究与体内 QT 研究在风险识别中具有互补关系；面向注册提交的相关研究应尽可能满足 GLP 要求，且综合风险评估应最终体现在研究者手册和非临床总体评价文件中。E14 则更聚焦临床 QT/QTc 评估本身，强调 ECG 采集方法学、临床设计严谨性及阈值解释的规范性。到了 2022 年，E14/S7B 问答进一步明确：如果非临床研究按照最佳实践执行并提示低风险，同时高质量临床 ECG 数据也未显示明显 QTc 延长，则这些证据可以被整合，用于支持后期开发和标签决策；相反，如果只有 hERG 阻断信号或 QT 改变，而缺乏更多机制与暴露信息，则不应做过度简化的二元式结论。

CiPA 理念的提出，本质上是对“hERG 阻断 = 临床致心律失常”这一过度简化推断的修正。其核心思想是：先在异源表达系统中测量多个关键心脏离子通道的阻断效应，再把这些数据输入到人心室肌细胞的 in silico 模型中，最后结合人源心肌细胞读数和早期临床 ECG 数据，形成更具有机制解释力的风险框架。现有文献提示，这一路线有助于在保持风险敏感性的同时提高特异性，尤其适合处理维拉帕米、雷诺嗪、胺碘酮等“单看 hERG 或 QT 结果难以正确归类”的多通道药物。

3.2 hERG 生物学与 TdP 相关性

hERG 基因变异是 LQT2 的分子基础之一。该基因产物构成 IKr 的关键孔形成亚基，在心室动作电位第 3 相复极中承担核心角色。S7B 明确指出，IKr 与 IKs 是决定动作电位时程和 QT 间期的关键外向电流，其中药物性 QT 延长最常见的机制之一，就是对承担 IKr 的延迟整流钾通道产生抑制。正因如此，hERG 在药物安全性筛选中始终具有非常高的敏感性。

但 hERG 并不等于全部心脏风险。TdP 往往发生在“显著延迟复极、触发活动和易感心脏基质”三者共同叠加的背景下。QT 延长通常先于 TdP 出现，但 TdP 的发生还与早后除极、心率、低钾、结构性心脏病、多药联用及个体易感性等多因素共同决定。换言之，hERG 阻断是一个极其重要的风险信号，却不是充分条件。多离子通道联合作用既可能缓冲 hERG 阻断所造成的 APD/QT 延长，也可能在特定条件下进一步放大风险。

方法

4.1 方法学前提与假设

在未明确指定实验平台、细胞系和化合物类别的前提下，本文采用如下示例性假设：第一，测试对象以小分子候选药物为主；第二，体外主试验采用稳定表达 hERG1a 的 HEK293 或 CHO 细胞；第三，核心读数方式为手动全细胞电压钳；第四，近生理温度方案作为主方案，而室温方案仅用于历史数据桥接或特殊比较；第五，载体通常为 DMSO，且必须设置等量 vehicle 对照。凡与这些假设不同的真实项目，原则上都应通过实验室内部桥接验证、参考药再校准以及正式报告中的偏差说明来保证数据的可解释性。需要说明的是，这一前提部分属于方法学建议，不等同于法规原文。

4.2 手动全细胞 hERG SOP 主方案

一个与 ICH S7B Q&A 2.1 和 FDA 推荐协议保持一致的 hERG 手动膜片钳工作流，通常包括以下关键步骤：

注：上表所列主参数主要综合自 FDA《Recommended Voltage Protocols to Study Drug-Cardiac Ion Channel Interactions Using Recombinant Cell Lines》与 ICH S7B Q&A 2.1。其中“6–8 个浓度”“50–80% 为常见经验区间”等内容属于本白皮书基于公开证据提出的实验室实施建议，并非硬性法规条文。

需要特别指出的是，温度和刺激波形会明显影响某些药物的 hERG 表观阻断效价。已有研究表明，step-ramp 波形结合近生理温度可减少部分药物效价被低估的情况，并使不同药物在标准化条件下的 IC₅₀ 变异控制在更合理范围内。因此，若实验室继续使用室温方案或历史 step 协议，必须通过参考药桥接来证明结果与主方案之间具有足够一致性。

4.3 数据采集、分析与统计

对单细胞记录而言，推荐将达到稳态后的药后 hERG 电流与药前基线 hERG 电流进行比较，计算分数抑制率：

其中，I_drug 和 I_baseline 原则上应基于连续 5 条痕迹的平均峰电流计算；若使用 E-4031 敏感电流，则应先完成背景扣除。浓度–反应关系通常采用 Hill 方程拟合，主终点至少应包括 IC₅₀ 与 Hill 系数；IC₂₀ 可以作为早期筛选或与暴露水平比较时的补充指标，但应在报告中明确说明其不是当前 ICH / FDA 体系下的核心 hERG 主终点。

在统计层面，最重要的并不是给出一个单一的 IC₅₀ 数值，而是对不确定性进行充分表征。按照 ICH S7B 问答思路，研究应报告每个细胞在各浓度下的抑制值、均值 IC₅₀、Hill 系数以及相应变异性。如果研究结果将用于安全边际判断，还应尽可能量化实验性 IC₅₀ 的变异范围，并在安全边际解释中体现这一不确定性。对于示范性验证研究，建议同时给出实验内变异、批间变异与历史对照范围；对于多天、多板实验，则可采用分层模型或混合效应模型做敏感性分析。

对于常规筛选项目，一个最低限度可接受的 QC 集合应至少包括：封接电阻、输入电阻、持有电流、串联电阻及补偿策略、基线稳定性、达到稳态所需时间、末端全阻断有效性、浓度实测结果，以及原始未改动波形文件。若基线出现 run-up 或 run-down 并进行了校正，则校正算法和应用方式都应在报告中保持可追溯。

结果示例

以下结果仅用于示范推荐的报告呈现方式，属于教学用途的虚拟数据，不代表真实研究结果，也不构成任何真实化合物的结论。

5.1 示例数据表

5.2 示例图形

在正式监管报告中，至少还应补充三类关键质量图：第一，代表性原始波形以及 E-4031 扣除背景后的波形；第二，单细胞时间过程图，用于展示电流振幅、输入电阻和持有电流变化；第三，名义浓度与实测浓度之间的偏差图。对于 hERG 研究而言，这些图并非装饰性材料，而是判断记录质量、药物是否达到平衡、背景扣除是否合理的重要证据。

讨论

6.1 方法学验证、接受标准与通量定位

S7B 原始指南要求体外电生理研究使用适当阳性对照，以证明系统具有充分响应性。2022 年问答进一步强调，阳性对照应尽量来自参考药集合，并设置至少两档以上能够实现 20–80% 阻断的浓度，同时保证足够重复数，以验证实验的一致性和可重复性。如果阳性对照结果偏离实验室历史预期范围，则该研究原则上应被视为不确定，不宜直接作为支持 E14/S7B 整合论证的关键依据。也就是说，真正有价值的“接受标准”从来不是某一次成功封接本身，而是“参考药响应正确、vehicle 稳定、原始数据可追溯、暴露得到核验、模型拟合可解释”共同构成的整体体系。

在心脏安评中的平台分工上，手动膜片钳和自动膜片钳并不是彼此替代关系，更合理的理解是分层使用。手动平台更适合用于参考药校准、疑难化合物研究、低溶解度 / 高吸附 / 缓慢平衡化合物处理、机制解析、方法学桥接以及注册关键数据生成；自动平台则更适合早期大规模筛选、SAR 迭代以及多离子通道的并行优先级排序。现有综述与方法学文献总体一致认为：手动膜片钳在数据质量和灵活性方面仍是金标准，而自动化平台则在标准化和通量上更具优势。

6.2 心脏风险解释与外推

hERG 结果向临床风险外推时，真正的核心变量并不是 IC₅₀ 本身，而是 IC₅₀ 与临床相关暴露之间的关系。S7B Q18 建议利用 IC₅₀ 相对于临床相关暴露来计算安全边际，并在支持 E14 Q12 / Q13 相关决策场景时优先采用高临床暴露作为分母。若血浆游离分数测得低于 1%，则建议按 1% 处理，以避免因蛋白结合测定误差导致边际被人为放大。更重要的是，现行 ICH 并不支持脱离实验协议和参考药集合、机械套用单一普适阈值；安全边际应建立在相同协议条件下的一组已知 TdP 风险参考药基础上。

历史上，“hERG IC₅₀ 至少高于治疗游离暴露 30 倍”曾经被广泛视为经验性出发点，但后续研究已经反复提示，这一经验法则存在明显例外，不能被视为固定监管标准。原因在于：某些药物虽然 hERG 阻断较强，但同时阻断 ICaL 或 INaL，因此并不一定表现为高度致扭转；另一些药物则可能通过多通道或非离子通道机制增加风险。今天更稳妥的路径，是把 hERG 看作一个高敏感性的闸门，再用体内 QT、动作电位 / 心肌细胞读数以及 CiPA 式 in silico 模型来提升特异性。

对于未来打算将 hERG 数据进一步用于 in silico 模型输入或监管沟通的实验室而言，一个非常现实的启示是：药物暴露实测、原始记录归档、参考药校准和历史性能监控，必须作为常规流程提前建立，而不能等到结果出现争议之后再去补救。

6.3 局限性、故障排查与开放问题

hERG 手动膜片钳的主要局限性可以概括为五类。第一，温度与波形依赖性：某些药物在室温下会被低估，或者在非生理波形下表现出明显偏移的表观效价。第二，给药学问题：疏水性、高吸附性或低溶解度化合物可能在管路、腔室和塑料耗材中损失，使名义浓度与真实细胞暴露不一致。第三，记录稳定性问题：密封下降、漏电流增大、持有电流漂移、输入电阻下降和 run-down 都会直接影响抑制率。第四，未达稳态的问题：慢结合化合物如果暴露时间不足，往往会系统性低估 IC₅₀。第五，生物学外推问题：hERG 只覆盖 IKr，并不能独立反映多通道联合作用、活性代谢物效应、心率依赖性以及患者易感背景。

在实际故障排查中，更有效的顺序通常是：先检查暴露，再检查记录稳定性，最后再回到生物学解释。例如，当出现“阳性对照偏弱”时，应优先检查温控、平衡时间、浓度损失和波形校准；当出现“vehicle 漂移”时，应回头检查封接质量、漏电流、持有电流和输入电阻；当出现“IC₅₀ 与历史值明显偏离”时，应重新核对实测浓度、原始波形、串联电阻补偿策略以及参考药同批结果。尤其需要注意的是，在近期多实验室标准化研究中，即使在相同协议下，hERG 效价的自然波动也可达约 5 倍，因此不应将较小数值差异过度解读为真实药效差异。

目前仍存在若干值得持续关注的开放问题。其一，是否存在跨实验室普适的 hERG 安全边际阈值，现有证据更支持实验室特异性阈值而非一刀切阈值。其二，串联电阻补偿程度对不同实验室 hERG 主终点的影响边界仍需进一步量化。其三，如何把 hERG 急性阻断、转运 / trafficking 效应、活性代谢物以及更长时程的人源心肌细胞表型系统性整合进监管模型，仍然是 CiPA 体系发展过程中的关键问题。

6.4 推荐报告格式与模板

面向注册或关键决策场景的 hERG 手动膜片钳报告，建议至少包括以下内容：研究目的与项目上下文；细胞系与表达构建信息；仪器、放大器与 digitizer 配置；内外液配方；温度记录；电压协议与液接电位校正；给药系统与平衡策略；阳性 / 阴性对照设置；单细胞原始波形；时间过程 QC 图；名义与实测浓度；单细胞抑制数据表；IC₅₀/Hill 拟合图及参数表；安全边际计算；偏差与例外说明；最终结论及其不确定性。FDA 2021 推荐协议还强调，应尽量保留未经基线扣除或归零处理的原始波形文件，并在概述文件中逐一标明温度、加药浓度、扣除方式等元数据。

6.5 伦理与法规考虑

S7B 已明确提出，用于注册的体外 IKr 与体内 QT 研究原则上应满足 GLP 要求；综合风险评估应体现在研究者手册和非临床总体评价中。2022 年问答还进一步提出：若后续研究中引入 hiPSC-CM 等系统，则需清楚说明细胞来源、供体特征、平台特性、纳入标准和分析软件。由此可见，伦理与法规合规的重点并不只是“做没做实验”，更在于“能否证明记录真实、样本来源可追溯、分析流程透明，并且足以供审评复核”。

另外，更新后的 S7B / E14 体系鼓励在合适场景下用高质量体外数据与 in silico 数据减少不必要的动物实验，这也与 3R 原则一致。对于采用人源心肌细胞或更复杂人源模型的项目，还应同时关注供体知情同意、样本匿名化、供应商合规文件以及跨批次一致性。虽然这些议题超出了狭义 hERG 手动膜片钳主试验本身，但在当前心脏安全评价项目中已经成为不可忽视的治理要求。

结论

hERG 手动全细胞膜片钳并没有因为 CiPA 或自动膜片钳的发展而失去价值。恰恰相反，在今天更强调机制化和整合式解读的心脏安全评价体系中，它仍是最重要的高分辨率基础证据来源之一。它最合适的角色，不是孤立地充当一个简单的“淘汰器”，而是在严格 SOP、可靠暴露核验、充分 QC 和参考药校准的前提下，成为整合风险评估中的关键输入。

对研发团队而言，真正决定 hERG 结果能否用于监管沟通或关键项目决策的，不是是否得到了一个“漂亮”的 IC₅₀，而是是否建立了一个可复现、可追溯、可桥接、能够与临床暴露对接的方法学体系。未来最值得投入的方向，也不是继续追求脱离情境的单一“万能安全边际”，而是把实验室标准化、历史控制、浓度实测、CiPA in silico 输入质量和多通道解释框架真正整合起来，使 hERG 从一个“高敏感但特异性有限的预警信号”，提升为一个可审评、可迁移、并且能够量化不确定性的心脏安评证据。

参考文献