小胶质细胞是中枢神经系统中的常驻免疫细胞，广泛参与神经稳态维护、损伤应答以及突触重塑等多种生理和病理过程。 在应激和成瘾模型中，其形态和功能状态高度动态，成为研究神经精神疾病的重要窗口。 尽管近年来转录组和蛋白组等高通量手段逐步兴起，形态学分析依然以其直观性和区域特异性，在神经免疫研究中占据重要地位。

为什么选择共聚焦成像？

小胶质细胞形态复杂，呈现从高度分支的静息态到无分支的活化态的一系列变化。 要捕捉这些细微差异，仅依赖二维图像往往信息不足。 通过共聚焦显微镜获取三维图像，不仅能精准记录细胞突起的走向和长度，还能在保持组织结构完整性的前提下，进行分层分析和空间重构。 这对研究细胞功能状态变化提供了可靠的形态学基础。

为了确保图像采集的一致性和可重复性，研究人员通常选择以解剖学参考点进行定位。 以伏隔核核心区（NAcore）为例，利用前连合作为定位坐标，在该区域不同投射通路（如以谷氨酸为主要递质的前额叶皮层神经投射）下获取特定位置的图像， 可在不同实验组之间实现精准对比。

图像分析平台：IMARIS vs CellSelect-3DMorph

形态学数据的提取和分析高度依赖后期软件处理。 当前主流平台包括商用软件 IMARIS 和开源工具 CellSelect-3DMorph，两者在功能和适用场景上各具优势：

其中，CellSelect-3DMorph 引入了 “分支指数” 作为评价细胞复杂度的重要参数，即细胞投影面积与体积的比值。更高的值代表更为分支的状态，便于从形态角度快速评估小胶质细胞的活化趋势。

ATP 处理实验揭示形态变化的可量化特征

研究者通过给予大鼠腹腔注射 ATP，诱导小胶质细胞的活化，并在 2 小时后采集 NAcore 区域组织进行共聚焦成像。采用两种分析工具处理同一批数据，结果高度一致：ATP 处理组小胶质细胞表现出枝突数量减少、细胞体积缩小、分支复杂度下降，体现出向类变形细胞（amoeboid）状态的转变。

更进一步的聚类分析揭示了小胶质细胞的亚群异质性。传统形态学分析以单指标为主，难以揭示细胞亚群异质性。为此，研究团队采用PCA降维结合双步聚类的策略，对提取的多个参数进行多维建模，成功划分出3种形态亚型群： Cluster 1：典型的amoeboid状态，体积小、分支少、分支指数低； Cluster 2：中间态，具备一定分支但体积偏小； Cluster 3：分支指数较高，代表相对静息态； 值得注意的是，ATP处理主要引起Cluster 2与3中细胞体积的显著下降，但整体群体构成比例未发生重大变化，提示功能改变更多来源于状态转换而非细胞迁移或凋亡。这一方法的引入使得研究者不仅能观察平均水平的变化，还能解析微观群体层面的状态迁移。

结语：推动共聚焦成像标准化应用

形态学虽无法全面揭示功能状态，但其在可视化、区域性和跨时间点比较中的优势使其仍是神经免疫研究的重要支柱。本文所介绍的标准化共聚焦成像，结合先进图像分析工具，不仅提升了数据解读的精度和效率，也为下游与蛋白组、转录组整合分析提供了高质量的数据基础。

我们在此基础上构建了系统的共聚焦成像服务平台，具备以下优势：

• 技术成熟：采用高分辨率共聚焦显微镜，支持 3D 成像、Z-stack 优化采集；
• 分析灵活：支持 IMARIS 与开源工具双路径分析，兼容多类样本；
• 研究定制：可根据客户需求定制图像采集参数及分析指标；
• 结果标准化：输出统一格式的图像与定量参数报告，便于发表或进一步整合分析。

欢迎广大科研人员与我们联系，共同推进脑科学、神经免疫及精神疾病研究的深入发展。

参考资料：

Taborda-Bejarano, J.P., Nowak, D.B., Chaure, F., et al. Decoding Microglial Morphology: Methodological Advances in Confocal Imaging and Analysis. Preprints 2025, 202507.1563.v1. https://doi.org/10.20944/preprints202507.1563.v1