为什么需要“更像人脑”的体外模型？

传统评估依赖二维细胞单层与动物试验：前者简便但缺乏细胞-细胞与细胞-基质的立体交互，后者则受物种差异、代谢差异与成本周期限制，均可能导致对人类结论的可译性不足。

三维培养通过仿生水凝胶提供更接近体内的微环境，使神经干细胞能够形成类组织结构与网络，改善信号传导与表型稳定性，从而提升毒理学预测的可信度。

核心平台：3D 神经干细胞 × 384 柱板 × 高内涵成像

研究方案采用微型 3D 生物打印将人源神经干细胞包埋于仿生水凝胶中，并精确打印到384 柱板的每个微柱；随后将柱板与标准 384 孔板“夹层”配合，实现培养、暴露与染色一体化，最后用自动化荧光成像系统批量采集图像用于高内涵分析。该设计兼顾高通量、低用量、易自动化与兼容标准设备。

与常见的 U 形低黏附板或悬滴模型相比，柱板方案在样品消耗、换液/染色的操作便利性、以及与自动成像/分析链路的耦合上更具优势，便于将多种细胞类型与多类化合物条件组合成系统化的筛选矩阵。

一条龙工作流：从打印培养到数据学判读

1. 表面功能化与细胞打印：先对柱板表面进行化学功能化，帮助水凝胶稳固附着；随后将神经干细胞与仿生基质配制成悬液，微量打印到各微柱形成 3D 培养单元。
2. 三维培养与化合物处理：柱板与孔板“夹层”以维持营养交换与统一给药；可按不同浓度/时间设计暴露方案，用于构建剂量-效应关系。
3. 多指标荧光染色（HCI 终点）：可在同一平台上以多色染料评估诸如线粒体功能、DNA 损伤、细胞膜完整性、谷胱甘肽水平与程序性细胞死亡等关键通路，适配高内涵成像的多终点读出。
4. 自动化成像与批处理：利用自动荧光显微系统批量采集整板数据；再通过图像软件进行背景扣除、阈值分割与整板批处理，得到标准化的荧光强度矩阵。
5. 剂量-反应建模与质量控制：以标准非线性回归获得IC₅₀等参数；用Z’ 因子与CV评估方法稳健性与板内/板间一致性，确保可重复、可比对。

策略规划：设备、细胞系与自动化的协同

平台推荐使用能够精确分配微量生物墨滴的打印设备与自动化荧光成像系统；在细胞系选择上，文献示范了人源神经干细胞模型，兼具自我更新与分化潜能，可覆盖神经元、星形胶质细胞与少突胶质细胞谱系，因而适合于从“发育毒性”到“功能毒性”的多场景体外研究。

关键环节与常见问题：从“凝胶-打印-成像”到“稳定性-一致性”

• 水凝胶与表面化学的匹配：需权衡凝胶成胶机理、打印黏度、细胞相容性与柱面附着稳定性；不恰当的表面/凝胶组合可能导致“斑点脱落”或长培后结构退化。
• 打印阶段的细胞均一性与生存：维持细胞在基质中的均匀悬浮，并在打印/成胶阶段避免水分挥发，可显著提升活性与板内一致性。
• 培养密度与过度生长风险：过高密度可能诱发基质重塑、营养梯度异常与成像困难；需在“可成团、可读出”与“不过度增长”之间取得平衡。
• 多色染色的信噪与时机：不同死亡通路或亚致死损伤的出现具有时间依赖性，染色条件与曝光时点应与机制假设配套，以获得可解释的多终点矩阵。
• 常见故障排查：若出现凝胶斑点脱落，需检查培养基成分中的螯合剂、细胞分泌的基质金属蛋白酶活性，以及柱面功能化是否到位。

结果读什么：从 IC₅₀ 到机制线索的拼图

通过在同一体系下对多条细胞通路进行并行读出，可以获得每个化合物多维的“毒性指纹”。研究实践表明，比较不同终点下的 IC₅₀ 与剂量-反应形态，能够帮助识别可能的作用位点与事件顺序；而在较大化合物集上评估灵敏度/特异度，有助于建立可预测的细胞模型基准。

参考与来源

1. Kang S-Y, Joshi P, Lee M-Y. High-throughput screening of compound neurotoxicity using 3D-cultured neural stem cells on a 384-pillar plate. Curr Protoc. Final edited form 2021; in PMC 2022.（本文全部叙述与方法细节均基于此文的原理与流程描述。）