为什么线粒体mRNA“难以被看见”？

线粒体DNA（mtDNA）约16.6 kb，多个拷贝压缩成核样体（nucleoid），转录产生多顺反子前体RNA，随后在“RNA颗粒（granules）”中加工成成熟mRNA、tRNA和rRNA。与核基因表达系统不同，线粒体的表达与加工具有独特复杂性；而线粒体管径细小，使常规光镜难以解析其亚结构与分子分布，这正是超分辨成像介入的动因。

方法总览：smFISH × STED / MINFLUX的两类“纳米镜头”

研究提出两条路径：其一，STED-smFISH利用分支DNA（bDNA）放大策略在保持特异性的同时增强信号强度，适合高通量统计的二维超分辨；其二，MINFLUX-smFISH将PAINT式可逆配对引入探针设计，通过单分子定位实现纳米级三维重建与形态判读。两者优势互补：STED获取大样本量、统计稳健；MINFLUX解析极限分辨与单分子形态。

STED-smFISH：在亚百纳米分辨率下“点亮”线粒体mRNA

在U-2 OS等细胞中，研究对多种线粒体mRNA（如MT-ND1、MT-CO3、MT-CYB）进行三色STED成像，单条mRNA呈离散可分辨信号。值得注意的是，分支放大“树”理论上会增大光斑尺寸，但实测信号的半高宽表明结构趋于“塌缩”，在统计意义上减小了对真实mRNA尺度估计的偏差。

STED的判别力不仅体现在“看见”单分子，还体现在可比较不同mRNA之间的空间关系：不同物种的配对距离分布相近，符合线粒体多顺反子转录并即时加工的机制学预期。此外，通过对照无mtDNA细胞（Rho0），研究验证了探针特异性。

MINFLUX-smFISH：把“点”拉近到单分子形态

MINFLUX借助局域激发“零最小值”的定位机理，将荧光团定位精度推进至单位纳米量级；结合DNA-PAINT，研究实现了目标mRNA沿长度方向的“点云”覆盖，反映出从紧致到伸展的多样化折叠形态，并能在三维空间内估计不同mRNA分子之间的最小距离。与STED相比，MINFLUX的成像体积更小、时间更长，但换来的是前所未有的形态细节。

将MINFLUX数据“卷积”模拟为STED图像可见，两者在斑点大小与距离估计上存在系统差异，主要由标签体量与成像物理差异引起；但这也提示：统计稳健性（STED）与极限分辨率（MINFLUX）是该体系的两端，需要根据问题选择工具。

在“真实问题”上的表现：从加工障碍到细胞死亡

加工受损模型：下调线粒体RNase P的催化亚基后，mRNA簇与mtDNA簇的比值上升，并伴随RNA颗粒标志蛋白的聚集与重分布，提示多顺反子加工与mRNA空间组织发生系统性改变。

转录受抑模型：抑制线粒体RNA聚合酶后，mRNA与mtDNA水平均下降，RNA颗粒分布更为均匀，这与既往群体生化数据相吻合，证明成像读数与分子水平变化的一致性。

细胞凋亡情境：在药物诱导的凋亡细胞中，STED-smFISH直接观察到线粒体mRNA从线粒体外膜孔附近“溢出”的现象，与膜结构破裂的经典过程相呼应，并量化到线粒体内受限的mRNA显著减少。

面向临床相关细胞：单点突变也能被空间转录组学“看见”

在携带线粒体tRNA-Glu单点突变的患者原代成纤维细胞中，研究发现特定mRNA（如MT-CO1）丰度下降，同时核样体与RNA颗粒的空间指标亦发生改变。STED-smFISH以“单细胞—亚线粒体”尺度揭示这些细微但一致的差异，为线粒体疾病的分子病理学提供了新的观察窗口。

适用边界与方法学权衡：让“分辨率”与“统计学”握手

研究在多种细胞类型上验证了探针与成像流程的可移植性。需要认识到：STED放大策略理论上可能增大信号体量，但数据支持其在mRNA上趋于塌缩；MINFLUX则在三维纳米分辨率上具备独特优势，代价是更长的成像时间与更小的样本量。两类手段的互证与互补，构成了可靠的“空间—分辨—统计”三角支撑。

参考与来源

1. Stoldt S., Maass F., Weber M., Dennerlein S., Ilgen P., et al. Super-resolution microscopy of mitochondrial mRNAs. Nature Communications (2025). DOI: 10.1038/s41467-025-61577-5.