了解我们的脑片膜片钳服务
膜片钳电生理实验所需的基本材料与试剂
仪器设备
在进行膜片钳电生理实验时，确保准备好合适的材料和试剂至关重要。以下是按类别划分的必备仪器设备和实验室附件清单：
- 膜片钳放大器
- 微操纵器
- 倒置显微镜
- 振动隔离台
- 数据采集系统
- 振动切片机
- 微电极与拉针仪
- 记录腔
- 灌流系统
- 法拉第笼
- 放大器前置头安装座
实验室试剂
- 胞内溶液（Intracellular Solution）
- 胞外（灌注）溶液（Extracellular/Bath Solution）
- 切片液（Cutting Solution）
- 记录/孵育液（Recording/Incubation Solution）
- 琼脂糖（用于脑组织切片）
- 酶解液（如胰蛋白酶）用于细胞分离
- 增强封接的试剂
准备好上述材料和试剂并保持有序，将有助于提高膜片钳实验的效率，确保结果准确可靠。
膜片钳电生理实验的溶液配制及配方
胞外溶液（External Solutions）
表 1：典型哺乳动物膜片钳实验中使用的胞外溶液（ECS）示例
胞外溶液旨在模拟体内或体外培养条件下细胞外液的离子组成，通常作为灌注液（Bath Solution）使用，其中主要成分是氯化钠。pH 和渗透压在形成高质量封接时比离子浓度更关键。
| 化学成分 |
ECS 浓度（mM） |
| Na⁺ |
126 |
| K⁺ |
6 |
| Mg²⁺ |
2.5 |
| Ca²⁺ |
1.2 |
| Cl⁻ |
125 |
| GTP |
0 |
| ATP |
0 |
| HEPES |
10 |
| 葡萄糖 |
11 |
| 蔗糖 |
67 |
- 典型 pH 值与渗透压：
- ECS 的 pH 通常用 NaOH 调节至约 7.4
- 渗透压一般为 300–310 mOsm
切片液（Cutting Solution）
- 用于获取急性脑片
- 特点是低钙（约 0.1 mM Ca²⁺）高镁（约 3 mM Mg²⁺）
- 目的在于在脑组织切片时降低神经元兴奋性，避免兴奋性毒性，从而保护神经元完整性
记录/孵育液（Recording/Incubation Solution）
- 用于灌注腔和切片后的孵育阶段
- 典型成分为 2 mM Ca²⁺ 和 1 mM Mg²⁺
氧合处理
将 ACSF（人工脑脊液）用 95% O₂ / 5% CO₂ 混合气体（Carbogen）进行充分氧合，以维持溶液功能。
胞内溶液（Internal Solutions）
表 2：膜片钳实验中典型胞内溶液（ICS）示例
胞内液用于填充微电极，用于全细胞记录或片段膜片（outside-out）记录，主要以高浓度钾离子为主，模拟细胞内环境。
| 化学成分 |
ICS 浓度（mM） |
| Na⁺ |
5 |
| K⁺ |
147 |
| Mg²⁺ |
1.2 |
| Ca²⁺ |
0 |
| Cl⁻ |
150 |
| GTP |
0.1 |
| ATP |
5 |
| HEPES |
20 |
| 葡萄糖 |
11 |
| 蔗糖 |
0 |
- 典型 pH 值与渗透压：
- ICS 的 pH 通常用 KOH 调节至约 7.2–7.3
- 渗透压一般为 290–300 mOsm
制备 ICS 的注意事项：
- 准确调节 pH：
- 所有成分完全溶解后再测量 pH；
- 使用 KOH 微调至 7.2–7.3，注意碱的加入量，避免剧烈波动。
- 试剂纯度与灭菌：
- 使用高纯度试剂和超纯水；
- 使用 0.22 μm 滤膜进行过滤灭菌，去除微粒与微生物。
- 储存方式：
- 小体积分装，避免多次冻融；
- 存于 -20℃，使用前解冻；
- 明确标记配制日期与成分信息。
- 防止沉淀：
- 加入每种盐后充分振荡，确保完全溶解；
- 避免沉淀物堵塞微电极。
- 处理钙螯合剂：
- EGTA 或 BAPTA 等钙螯合剂需缓慢加入，并持续搅拌；
- 螯合剂完全溶解后再调节 pH。
制备胞外与胞内溶液的实用技巧
渗透压的重要性
渗透压在实验中常被忽视，其实是成功封接的关键因素之一。膜内外溶液渗透压差过大会造成细胞胀裂或收缩，甚至死亡。因此，务必确保内外溶液渗透压匹配。
实用溶液配置建议
- 浓缩母液：建议配置 10 倍浓度的 ECS 母液，用时稀释，可提高实验效率与一致性。
- 钙和葡萄糖后加：为防止钙盐沉淀及微生物滋生，常将钙和葡萄糖排除在母液之外，使用当天再加入。
- ICS 的保存方式：含 ATP 等易降解组分的 ICS 应分装冷冻，按需解冻，保持活性。
附加建议与提示：
- pH 调节：所有成分完全溶解后再调 pH，谨慎滴加 NaOH 或 KOH，避免剧烈变化。
- 灭菌过滤：使用 0.22 μm 滤膜过滤所有溶液，尤其是 ICS，确保无杂质和污染。
- 清晰标记：溶液容器需注明名称、浓度、成分及日期。
- 防止沉淀：逐步溶解每种盐，并充分混匀。
- 储存条件：ICS 冷冻储存，ECS 若短期使用可常温保存。
- 钳制实验加封闭剂：如钙突触反应过强，可在 ICS 中加入 2 mM QX314（如 N-(2,6-dimethylphenylcarbamoylmethyl) triethylammonium chloride）以阻断内源性钠通道。
- 使用 CsF 内液易封接：若氟离子不干扰实验，推荐使用 CsF 内液替代 Cs-gluconate，封接效果更佳。
- 预防 ACSF 中钙沉淀：在加入 Ca²⁺ 之前先鼓泡氧合可有效避免沉淀（溶液变浑浊即为沉淀）。
- CaCl₂ 储备液制备：配置 1 M CaCl₂ 储备液，冷藏于 4℃，每次按需加入。
- MgCl₂ 可直接采购：可从 Sigma 直接购买 1 M MgCl₂ 溶液使用。
琼脂糖溶液配置指南
材料：
- 1.5 克低熔点琼脂糖粉末
- 100 ml HBSS/HEPES 缓冲液
步骤：
- 使用电子天平称取 1.5 克低熔点琼脂糖。
- 于烧杯或烧瓶中加入 100 ml HBSS/HEPES 缓冲液。
- 将琼脂糖加入缓冲液中。
- 用微波炉间歇加热，同时搅拌，直到完全溶解。注意避免过热。
- 溶解完成后稍微冷却，即可用于肺组织固定。
注：此配方可制备 100 ml 的 2% 琼脂糖溶液，适用于多份肺组织处理，可按需调整用量。
替代方案：使用 Precisionary Instruments 琼脂糖片
- 每片含 0.5 克琼脂糖，使用 3 片即可达到 1.5 克（2%）浓度。
- 每片琼脂糖搭配 25 ml HBSS/HEPES 缓冲液，总共加入 75 ml 即可。
- 溶解步骤与粉末方法相同。
注：片剂提供精准剂量控制，使用更方便，可提高实验一致性。
70% 乙醇溶液配制方法
材料：
步骤：
- 使用量筒量取 70 ml 无水乙醇。
- 使用另一个量筒量取 30 ml 蒸馏水。
- 将乙醇与水混合于干净容器中（如玻璃瓶）。
- 使用玻棒轻轻搅拌至完全混合。
- 贴标签注明“70%乙醇溶液”。
- 密封保存于室温，避免阳光直射或靠近热源。
注意：
- 请在通风良好区域操作，避免吸入乙醇蒸气；
- 乙醇为易燃液体，请小心使用并妥善处理废液，遵守当地危化品处理规定。
2025-10-17
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