钙成像技术筛选 CALHM1 激动剂：从大规模初筛到原代细胞验证

一、解码细胞信号：为何聚焦 CALHM1 与钙成像

钙离子 (Ca 2+ ) 是调节神经传导、肌肉收缩、细胞分裂和基因表达等多种生理活动的核心信使。钙稳态调节蛋白 1 (CALHM1) 作为一种新型质膜大孔离子通道，在调节大脑皮层神经元兴奋性及阿尔茨海默病病理过程中起着关键作用。

然而，目前已知的 CALHM1 调节剂极少，仅限于钌红和部分金属离子等抑制剂。为了深入研究其生理功能并开发治疗药物，寻找特异性激动剂或拮抗剂迫在眉睫。

钙成像技术通过可视化钙离子浓度的动态变化，为药物筛选提供了直观且高通量的解决方案。本文介绍的protocol通过整合基因编码钙指示剂 (GECIs) 与化学染料，构建了从大规模初筛到精确验证的完整工作流。

在钙成像实验中，选择合适的“探针”是成功的关键。该方案对比了两类主流指示剂：

基因编码钙指示剂 (jGCaMP8m)： 具有极高的亚细胞定位精度，信号强且能长时间稳定存在，但易受 pH 值波动影响。其工作原理是基于钙调蛋白 (CaM) 与钙结合后引发的构象变化，进而增强 GFP 的荧光强度。
化学钙指示染料 (Fluo-8)： 加载速度快、光稳定性好且亮度高，但缺乏亚细胞特异性，且在细胞内停留时间有限。通常制成乙酰甲酯 (AM) 酯类以方便穿透细胞膜。

该protocol建立了一套标准化的“三步走”验证流程，确保筛选结果的可靠性：

阶段	核心操作	目的
1. 大规模初筛	在 HEK293T 细胞中转染 jGCaMP8m-CALHM1，利用 Flexstation 对 5000+ 药物库进行测试。	快速识别具有激活潜力的化合物。
2. 高分辨率验证	利用荧光显微镜观察转染了 jGCaMP8m 的 HeLa 细胞，通过灌流系统切换钙离子浓度。	获得更高的时空分辨率，观察钙动力学细节。
3. 原代细胞复核	在小鼠主动脉血管平滑肌细胞 (VSMCs) 中加载 Fluo-8 染料进行成像。	在更接近生理状态的环境下验证激动剂效果。

为了从复杂的视频数据中提取定量信息，该protocol引入了基于 Python Jupyter 的自动化处理工具。研究者首先在 ImageJ 中划定感兴趣区域 (ROI)，随后通过 Python 程序自动识别细胞编号并输出每个细胞的荧光强度变化曲线。

研究亮点： 实验成功发现了一个名为 H11 的候选药物，在 Flexstation 监测下显示出显著的荧光增强。虽然其最终应用仍需进一步临床前验证，但这套标准化流程为针对 CALHM1 及其相关钙离子通道的药物开发提供了一个高效的范式。

"这一protocol不仅是技术的堆砌，更是为探索钙通道机制及相关疾病治疗提供了强有力的工具箱。"

[1] Wang H, Yang B, Mo L, Yang HQ. Intracellular calcium imaging for agonist screening. Biophysics Reports. 2025; 11(3): 164-171 . doi:10.52601/bpr.2024.240026.